基于Orbitrap ID-X技術(shù)的中藥柴胡體外腸內(nèi)菌代謝物分析

前言：傳統(tǒng)中藥以口服用藥為主，其化學(xué)成分受胃腸道酸堿性、腸道微生 物及代謝酶等影響常發(fā)生轉(zhuǎn)化，使其生物利用度降低，體內(nèi)除中藥 原形成分外，還可能有大量代謝產(chǎn)物的存在，這些體內(nèi)吸收化學(xué) 成分是闡明中藥發(fā)揮藥效機制的直接物質(zhì)基礎(chǔ)。要想揭示中藥體內(nèi) 藥效物質(zhì)，代謝產(chǎn)物研究是*的重要組成部分，尤其是苷類 及其他結(jié)構(gòu)易轉(zhuǎn)化的化學(xué)成分（如萜類等），其生物利用度較低， 在體內(nèi)主要以代謝產(chǎn)物的形式存在，在此種情況下，代謝產(chǎn)物可能 是藥效的主要來源[1]。然而，由于中藥成分的代謝規(guī)律不明 確、代謝產(chǎn)物含量低難以鑒定等原因，大大制約了中藥體內(nèi)藥效物 質(zhì)基礎(chǔ)的研究。 

為了更加深入的研究中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，需要利用高分辨質(zhì)譜 對中藥體內(nèi)代謝物進行更深度的鑒定分析。然而由于中藥體內(nèi)的代 謝物通常含量很低，且同時受到基質(zhì)背景的干擾，傳統(tǒng)LC Q-TOF MS高分辨質(zhì)譜的DDA數(shù)據(jù)采集模式難以獲得低含量代謝物的二級 質(zhì)譜圖用于結(jié)構(gòu)鑒定。新一代賽默飛Orbitrap ID-X Tribrid三合一質(zhì)譜儀由 于具有Acquire X智能化數(shù)據(jù)采集模式，自動迭代生成排除列表及 包含列表，可以獲得極低含量組分的多級質(zhì)譜用于代謝物的深度分 析。

柴胡Bupleuri Radix為傘形科植物柴胡（又稱北柴胡）Bulpeurum chinese DC. 和狹葉柴胡（又稱南柴胡）Bulpeurum scorzonerifolium Willd的干燥根，其性味苦涼、微寒，具有解表和里、疏肝解 郁、升舉陽氣之功效[2]。柴胡化學(xué)成分復(fù)雜，其中皂苷類、揮發(fā)油 類、黃酮類為柴胡的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗抑郁、保 肝、抗腫瘤、解熱抗炎等藥理作用[3-5]。近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用技術(shù)（LC-MS）的成熟與發(fā)展已被應(yīng)用于柴胡皂苷類組分的代謝研究[6,7]。然而，單個活性組分的代謝研究以及部分代謝物的鑒定結(jié) 果仍然無法全面綜合的評價柴胡的質(zhì)量和體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實驗采用離體實驗的代謝研究方法，通過具有AcquireX采集功能 的Orbitrap ID-X Tribrid MS技術(shù)對柴胡代謝產(chǎn)物進行整體分析。首先 用富含腸內(nèi)菌的糞便懸浮液與柴胡提取物在厭氧條件下溫孵，利用 Compound Discoverer 3.0代謝物分析軟件對采集的高分辨質(zhì)譜數(shù) 據(jù)進行解析，終構(gòu)建柴胡的腸內(nèi)菌代謝指紋圖，以期為中藥的臨 床合理應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

實驗方法

1. 樣品前處理 取柴胡粉末約20g，加入150mL 70%乙醇置于圓底燒瓶中，加熱 回流提取60min，離心后取上清液，抽濾后濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL，凍干保存。腸內(nèi)菌液的收集與制備參考文獻[8]，培養(yǎng)時間分 別為0小時（對照組），1小時和24小時作為實驗組樣品。用等量 的磷酸鉀緩沖溶液代替底物溶液，其它操作同實驗組，此作為空白 組。

2. 色譜方法 超高效液相UHPLC（Dionex Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific）系統(tǒng)進行色譜分離，該系統(tǒng)由真空脫氣機，自動進樣器，柱 溫箱，和二元泵組成。色譜柱為Hypersil Gold C18（2.1 mm × 100 mm，1.9μm，Thermo Fisher Scientic）；流動相為0.1％甲酸水 （A）和乙腈100%（B）。流速為0.3mL / min，進樣體積3uL， 柱溫40℃；采用梯度洗脫：起始，5%（B）；0-1min (5%-5％B); 1-5min (5%-50％B); 5-19min (50%-98％B); 19-23min (98%-98％B);23.1-25min (5% B)。

3. 質(zhì)譜條件 儀器：Thermo Scientic Orbitrap ID-X Tribrid 三合一質(zhì)譜儀，利用 AcquireX 智能數(shù)據(jù)采集模式獲得HR MS/MS，±ESI 檢測模式，離子 源參數(shù)如下：Spray Voltage ±3.5KV; Sheath Gas Pressure: 40arb; Aux Gas Pressure: 10arb; Capillary Temperature: 275℃; Heater Temperature: 350℃。質(zhì)譜掃描參數(shù)：掃描范圍 (Scan range)（m/z） ：120-1500；Full Mass分辨率(Orbitrap resolution)：120000，MS/ MS分辨率：30000；使用Xcalibur 4.1和 Compound Discoverer 3.0 化學(xué)工作站進行數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果和討論

1. Acquire X智能化數(shù)據(jù)采集模式 中藥代謝物由于其成分的高度復(fù)雜性，而且代謝物檢測容易受到基 質(zhì)的干擾，傳統(tǒng)的DDA模式很難采集到低含量代謝物的二級質(zhì)譜圖 進行定性分析，Orbitrap ID-X中的Acquire X智能化數(shù)據(jù)采集模式可 以自動生成排除列表及包含列表，特別適合于復(fù)雜樣品的深度分 析。AcquireX采集數(shù)據(jù)過程中，以溶劑作為空白對照，用于自動生 成排除列表，排除背景離子；柴胡體外腸內(nèi)菌孵育樣品用于生成包 含列表。采集過程中將自動進行數(shù)據(jù)處理，實時更新采集方法。如 某一離子已經(jīng)觸發(fā)了MS/MS碎片，在下一針采集將自動加入到排 除列表中，避免數(shù)據(jù)的冗余，節(jié)省出更多時間用于MS/MS離子的 觸發(fā)（如圖1所示）。

 2. 數(shù)據(jù)處理流程 數(shù)據(jù)處理采用Compound Discoverer (簡稱CD)的工作流程Metabolism Expected w FISh and Unknown w MDF Pattern and Compound Class Scoring進行代謝物的鑒定。實現(xiàn)自動峰提取、空白扣除、分 子式生成，代謝物查找及鑒定等步驟。軟件中嵌入了常見的Ⅰ相代 謝和Ⅲ相代謝反應(yīng)，可以用于已經(jīng)代謝物的快速查找和鑒定工作。 此外上述工作流程還集合了MDF，F(xiàn)ISh Trace，和Pattern Trace 多 種算法，可以用于未知代謝物的查找和鑒定（如圖2）。在對代謝 物完成峰提取后，CD可以將代謝物的二級質(zhì)譜圖與母藥的二級質(zhì) 譜圖進行鏡像比對，幫助進行代謝位點確定。

3. Fragment Ion Search (FISh) 自動輔助進行代謝位點確認 選擇柴胡中鑒定到的代表性物質(zhì)柴胡皂苷A和綠原酸為母藥，看這 些物質(zhì)在孵育基質(zhì)樣品中的代謝情況。下圖3a所示為柴胡皂苷A的 代謝物Dehydration+Dehydration+Stearyl Conjugation的二級質(zhì)譜 圖，綠色顏色標記的碎片為代謝物和母藥相同的碎片，藍色顏色標 記的碎片為代謝物的變化位點，由特征性碎片m/z 357.27844可知 此未知代謝物位點應(yīng)在葡糖糖上。下圖3b所示為綠原酸的代謝物 Dehydration+Dehydration+Acetylation的二級質(zhì)譜圖，由特征性碎 片m/z 169.01262可知此未知代謝物位點應(yīng)發(fā)生在奎尼酸上。

 結(jié)論：本實驗采用Orbitrap ID-X Tribrid MS高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合 Compound Discoverer軟件中的代謝物分析工作流程，對中藥柴胡 體外腸內(nèi)菌代謝物進行了快速準確的分析。Compound Discoverer 內(nèi)置I 相+II相代謝途徑，針對已知和未知代謝物開采用質(zhì)量虧損過 濾（MDF），碎片離子搜索策略（FISh），特征同位素，共有碎片 檢索等方式，尋找代謝物；同時軟件提供多種統(tǒng)計學(xué)工具，通過不 同給藥時間點或不同處理方式統(tǒng)計學(xué)差異，確證代謝物。選擇柴胡 中鑒定到的代表性物質(zhì)柴胡皂苷A和綠原酸為母藥，在孵育基質(zhì)樣 品中柴胡皂苷A正離子模式共鑒定出14種可能的代謝物，負離子模 式鑒定出11種可能的代謝物；綠原酸共鑒定出5種可能的代謝物。

參考文獻 [1] 邱峰, 淺談中藥成分體內(nèi)代謝研究, 藥學(xué)研究雜志，2010, 37, 321-327. [2] 中國藥典[S]. 一部. 2015. [3] Y. Motoo and N. Sawabu, “Antitumor effects of saikosaponins, baicalin and baicalein on human hepatoma cell lines,” Cancer Letters, 1994, 86, 91–95. [4] M. S. Idris-Usman, “Antinociceptive and antipyretic properties of the pharmaceutical herbal preparation, Radix bupleuri in rats,” Journal of Medicinal Plants Research, 2010, 4, 659–663. [5] B. P. Bermejo, M. J. A. Martinez, A. M. S. Sen et al., “In vivo and in vitro antiinammatory activity of saikosaponins,” Life Sciences, 1998, 63, 1147–1156. [6] G.Q Liu, Y.T, G. Li, L. Xu, R. Song, Z.J Zhang, Metabolism of Saikosaponin a in Rats: Diverse Oxidations on the Aglycone Moiety in Liver and Intestine in Addition to Hydrolysis of Glycosidic Bonds, Drug Metab Dispos, 2013, 41, 622–633. [7] Pei Yu, Hongcong Qiu, Min Wang, Yuan Tian, Zunjian Zhang, Rui Song. In vitro metabolism study of saikosaponin d and its derivatives in rat liver microsomes, Xenobiotica, 2017, 47, 11-19. [8] 馮桂芳, 劉舒, 皮子鳳, 宋鳳瑞, 劉志強, 基于超高效液相色譜-質(zhì) 譜聯(lián)用技術(shù)的人參皂苷體外I相代謝研究, 質(zhì)譜學(xué)報, 2017,