測定三文魚和牛肉中的 19 種多環(huán)芳烴

摘要：本應(yīng)用簡報(bào)介紹了用于分析三文魚和牛肉中的多環(huán)芳烴 (PAH) 殘留物的多殘留方法的開發(fā)與驗(yàn)證。該方法使用液相萃取以及 Agilent Captiva EMR-Lipid 凈化，并通過 GC/MS/MS 進(jìn)行分析。使用固/液萃取 (SoLE) 對(duì)三文魚或牛肉樣品進(jìn)行萃取，再通過 Captiva EMR-Lipid 凈化。然后使用異辛烷對(duì)凈化的樣品洗脫液進(jìn)行反萃取，以在安捷倫 GC/MS/MS 分析之前去除水。在兩步法 SoLE 中使用乙酸乙酯和乙腈的混合物，改善了脂質(zhì)食品基質(zhì)中 PAH 的萃取效率。Agilent Captiva EMR-Lipid 過濾柱能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品基質(zhì)的高效選擇性凈化，并采用三文魚和牛肉樣品對(duì)開發(fā)的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，所有檢測的 PAH 化合物均獲得了滿足歐盟委員會(huì)規(guī)定（回收率 50%–120%）的可接受的回收率結(jié)果，RSD 低于 20%，且三文魚和牛肉樣品中濃度為 1–500 ng/g 的分析物的校準(zhǔn)曲線 R2 高于 0.99。通過重量法測得，三文魚和牛肉樣品中基質(zhì)共萃取殘留物的去除效率分別為 60% 和 92%。

前言： PAH 是一類普遍存在的有毒化合物，其特征是具有熱力學(xué)穩(wěn)定的稠合芳香環(huán)結(jié)構(gòu)。這些化合物天然存在于原油和煤中，也可以于食品的加工過程中形成。PAH 化合物可根據(jù)稠合芳香環(huán)的數(shù)量進(jìn)行分類，例如分為輕 PAH（具有 2–3 個(gè)環(huán)）和重 PAH（具有 4–6 個(gè)環(huán)）。重 PAH 比輕 PAH 更穩(wěn)定且毒性更高。由于它們具有疑似或經(jīng)證實(shí)的致突變性或致癌性，這些化合物已經(jīng)得到廣泛研究和監(jiān)管。美國食品* (FDA) 要求對(duì)海鮮中低 ppb 級(jí)的 PAH 進(jìn)行分析1 。歐盟委員會(huì) (EC) 規(guī)定了四種重 PAH 化合物（苯并 (a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)熒蒽和?）的分析方法標(biāo)準(zhǔn)，要求每種 PAH 的定量限 (LOQ) 達(dá)到 0.9 µg/kg 且檢測限 (LOD) 達(dá)到 0.3 µg/kg2 。 PAH 為強(qiáng)親脂性化合物，容易在魚、肉、油和牛奶等脂質(zhì)食品中發(fā)生生物累積。脂質(zhì)食品基質(zhì)中 PAH 的分析所面臨的主要挑戰(zhàn)，是將目標(biāo)分析物與食品基質(zhì)中存在的大量脂質(zhì)化合物分離。這一挑戰(zhàn)包括從脂肪基質(zhì)中高效提取 PAH，然后選擇性去除不需要的脂肪基質(zhì)共萃取物。常用的樣品前處理技術(shù)包括索氏提取3 、超聲輔助固/液萃取4 、加壓溶劑萃取5 和 QuEChERS 萃取6 。這些技術(shù)可以與固相萃取7 (SPE) 或凝膠滲透色譜8 等凈化步驟配合使用。

安捷倫增強(qiáng)型脂質(zhì)去除 (EMR-Lipid) dSPE 凈化產(chǎn)品自 2015 年推出以來就備受關(guān)注。EMR-Lipid dSPE 吸附劑與脂類的無支鏈烴鏈發(fā)生選擇性相互作用，在溶液中留下大量目標(biāo)分析物以供后續(xù)分析。這一選擇性相互作用使其成為脂質(zhì)食品基質(zhì)中多類別多殘留分析的理想選擇。與傳統(tǒng)的 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid (50%) 相比，Captiva EMR-Lipid 過濾柱只需更少的水進(jìn)行吸附劑活化 (20%)。這一變化簡化了工作流程，并改善了疏水性化合物在凈化過程中的回收率9 。

本研究考察了使用 Captiva EMR-Lipid 過濾柱流通式凈化進(jìn)行樣品前處理，并通過 GC/MS/MS 分析三文魚和牛肉中的 19 種 PAH 化合物。開發(fā)此方法的目的在于，改善先前使用 Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid dSPE 凈化測定食品中 PAH 的方法的局限性10。表 1 顯示了所檢測的農(nóng)藥的分類、Log P 值、保留時(shí)間和 MS/MS 離子對(duì)。

實(shí)驗(yàn)部分：化學(xué)品與試劑 PAH 和內(nèi)標(biāo)來自 Ultra-Scientific (North Kingstown, RI, USA) 或安捷倫。HPLC 級(jí)乙腈 (ACN)、丙酮和乙酸乙酯 (EtOAc) 購自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。試劑級(jí)異辛烷購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。

溶液與標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮配制兩種濃度分別為 2000 µg/mL 和 500 µg/mL 的 PAH 儲(chǔ)備液。用丙酮由儲(chǔ)備液制得濃度為 4 µg/mL 的工作溶液。然后每天用丙酮新鮮配制濃度為 1 µg/mL 的加標(biāo)溶液以用于樣品加標(biāo)。用丙酮配制包含五種濃度為 20 µg/mL 的內(nèi)標(biāo)化合物的內(nèi)標(biāo)工作溶液。兩種工作溶液均置于棕色玻璃樣品瓶中，在 4 °C 的冰箱中儲(chǔ)存一個(gè)月。配制 20:80 EtOAc/ACN 萃取溶劑和 16:64:20 ACN/EtOAc/水洗脫溶液，室溫儲(chǔ)存。

儀器與材料將 Agilent 7890B 氣相色譜系統(tǒng)與 Agilent 7000D 三重四極桿 GC/MS 聯(lián)用開展研究。氣相色譜系統(tǒng)配備電子氣路控制 (EPC)、支持風(fēng)冷的多模式進(jìn)樣口 (MMI)、 Agilent 7693A 自動(dòng)液體進(jìn)樣器 (ALS) 以及基于輔助 EPC 模塊控制的吹掃 Ultimate 接頭的反吹系統(tǒng)。采用 Agilent MassHunter 工作站軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

結(jié)果與討論： EMR-Lipid 吸附劑和產(chǎn)品 EMR-Lipid 吸附劑使用新型化學(xué)鍵合相，它結(jié)合了體積排阻與疏水相互作用，可提供較高的脂質(zhì)去除選擇性和效率。僅含有無支鏈烴鏈的類脂分子能夠進(jìn)入 EMR-Lipid 吸附劑孔中，并通過疏水相互作用得以保留。不含類脂結(jié)構(gòu)的目標(biāo)分析物無法進(jìn)入吸附劑孔中，因此留在溶液中以供后續(xù)分析。因此，EMR-Lipid 吸附劑可以將脂質(zhì)與其他目標(biāo)分析物分開，提供較高的分析物回收率和脂質(zhì)去除效率。樣品前處理優(yōu)化樣品前處理方法優(yōu)化包括三個(gè)階段： 1. SoLE 2. Captiva EMR-Lipid 凈化 3. 用于除水的后處理萃取步驟對(duì)于實(shí)現(xiàn)脂肪基質(zhì)中疏水性 PAH 化合物的高回收率至關(guān)重要。樣品萃取的挑戰(zhàn)在于 PAH 分析物的高疏水性和脂質(zhì)食品基質(zhì)的復(fù)雜性。鑒于 SoLE 先前在萃取油基質(zhì)中疏水性農(nóng)藥方面的成功應(yīng)用9 ，直接使用 SoLE 和 20:80 EtOAc/ACN 萃取溶劑作為初步方案。針對(duì)分析物回收率對(duì)萃取時(shí)間和多次 SoLE 進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖 3A 所示。結(jié)果表明，萃取時(shí)間越長， PAH 萃取回收率越高。另外，與一步法 SoLE 相比，兩步法 SoLE 提高了萃取效率。因此，使用兩步法 SoLE 作為萃取方法，該方法采用 5 mL 萃取溶劑，并在每一步振搖 10 分鐘。

然后研究了 EMR-Lipid 過濾柱凈化的分析物回收率。由于 PAH 化合物具有非常強(qiáng)的親脂性（重 PAH 尤其如此），因此使用二次洗脫對(duì)于獲得良好的洗脫回收率非常重要。結(jié)果（圖 3B）表明，二次洗脫能夠使洗脫回收率平均提高約 20%– 25%。此外，使用更強(qiáng)的溶劑（16:64:20 EtOAc/ACN/水）可實(shí)現(xiàn)重 PAH 的洗脫。對(duì)樣品萃取和 EMR-Lipid 凈化進(jìn)行優(yōu)化后，考察了用于除水的后處理步驟。用于在 GC/MS/MS 分析之前除水的 EMR-Lipid 后處理方法主要有三種： • 使用無水 MgSO4 進(jìn)行鹽析 • 干燥和復(fù)溶 • 疏水性溶劑反萃取 (BE) 表 3 分別列出了這三種后處理程序的一般方法、優(yōu)缺點(diǎn)和適用性。由于 PAH 是一類強(qiáng)疏水性化合物，因此非常適合采用疏水性溶劑反萃取法。該方法可實(shí)現(xiàn)溶劑轉(zhuǎn)換和部分濃縮，并且對(duì)于輕 PAH 和重 PAH 化合物均適用。因此，在 Captiva EMR-Lipid 凈化后使用異辛烷溶劑 BE 除水。圖 3C 顯示了異辛烷 BE 步驟的回收率。使用這種優(yōu)化的方法，在三種加標(biāo)濃度下采集整個(gè)方法的分析物回收率：三文魚和牛肉樣品中加標(biāo)濃度均為 1 ng/g、10 ng/g 和 100 ng/g (n = 6)。盡管不同基質(zhì)間存在差異，但兩種基質(zhì)中不同加標(biāo)濃度的所有 PAH 分析物的回收率均處于可接受的限值范圍 (50%–120%)。