對人全血中的濫用藥進行LC/MS/MS 定量測定

摘要： Agilent Captiva 增強型脂質去除產品 (EMR-Lipid) 是第二代 EMR-Lipid 產品，采用便捷的 SPE 過濾柱或 96 孔板。本研究展示了采用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板對人全血中的 24 種代表性濫用藥進行 LC/MS/MS 定量測定。樣品的前處理方法為：采用孔內蛋白質沉淀法 (PPT) 去除蛋白質，然后采用 Captiva EMR-Lipid 凈化產品去除脂類。通過以下方式對該方案進行改進：首先加入全血樣品，然后加入沉淀溶劑以促進實現(xiàn)*的孔內 PPT。整個樣品處理在 96 孔板中作為一個批次執(zhí)行，并通過離心或正壓歧管完成樣品洗脫。整個過程簡單、快速，能夠在兩小時內完成 96 個樣品的前處理。高效基質凈化產品使磷脂去除率高于 99%，從而減小了基質離子抑制效應和系統(tǒng)污染。通過為期三天的準確度和精度運行對定量方法進行驗證，在所有加標濃度下均獲得了優(yōu)異的準確度 (100±20%) 和精度 (RSD < 15%)，全血中的定量限 (LOQ) 為 0.1–0.5 ng/mL，且線性校準曲線的 R2 高于 0.995。結果表明，采用孔內 PPT 和 Captiva EMR-Lipid 凈化產品建立的方案顯著改善了人全血中濫用藥化合物定量測定結果的可靠性。

前言：在法醫(yī)毒理學中，對快速可靠地篩查和定量測定生物樣本中的濫用藥 (DoA) 的需求正在不斷增加1–3，主要原因是濫用藥以及提交分析的樣品數(shù)量日益增多。過去，選擇尿液樣品進行篩查和鑒定。但是，必須對這些藥物的代謝物進行鑒定，由此增加了定量檢測的復雜度和不確定性。血液樣品（包括全血、血漿和血清）的分析日益重要。初，血漿是定量分析選擇的主要樣品基質，但是隨著樣品前處理和儀器檢測技術的改進，全血已成為鑒定和定量分析的基質。與尿液相比，使用血液作為樣品進行分析具有若干項優(yōu)勢。 • 首先，這種技術能夠在體內代謝和過濾之前立即檢測藥物 • 其次，因為生理參數(shù)變化的范圍非常窄，血液相對均勻 • 再次，幾個歐洲和美國一些地區(qū)要求毒駕 (DUID) 測試采用血液樣品4 因此，可靠地定量測定血液基質（尤其是全血）中的 DoA 對于常規(guī)毒理學分析非常重要。目前使用氣相色譜/質譜聯(lián)用系統(tǒng) (GC/MS) 和液相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用系統(tǒng) (LC/MS/MS) 對 DoA 進行毒理學檢測。然而，GC/MS 方法通常很耗時，并且通常需要在分析之前對分析物進行化學衍生5 。 LC/MS/MS 分析技術的優(yōu)勢在于檢測速度更快，且具有更高的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性6 。用于系統(tǒng)毒理學分析的樣品前處理方法包括液液萃取 (LLE)、固相萃取 (SPE) 和固相支持液液萃取 (SLE)。這些方法費力費時，并需要使用大量有毒溶劑。安捷倫增強型脂質去除產品 (EMR-Lipid) 吸附劑是一種新型吸附材料，能夠選擇性去除樣品基質中的主要脂類且不會造成分析物損失。EMR-Lipid 吸附劑提供的脂質去除機制是基于脂質化合物與這種*的吸附劑之間的體積排阻和疏水作用。這種相互作用機制能夠在 PPT 之后從生物體液中高選擇性且高效地去除磷脂及其他脂類。第二代 EMR-Lipid 吸附劑以 SPE 過濾柱/板形式包裝，只需使樣品通過吸附劑即可完成凈化。研究表明，使用 Captiva EMR-Lipid 96 孔板進行孔內 PPT，隨后進行流通式凈化，能夠有效去除生物體液中的磷脂，并實現(xiàn)人血清中代表性藥物的定量測定7,8。為證明 Captiva EMR-Lipid 96 孔板對于法醫(yī)學檢測的可行性，本研究選擇 24 種常見的 DoA 化合物。表 1 列出了所選化合物的化學特性和結構。使用為期三天的準確度和精度測試以及基質凈化評估對方法進行驗證。

實驗部分：試劑與化學品所有試劑和溶劑均為 HPLC 或分析純級。乙腈 (ACN) 購自 Honeywell (Muskegon, MI, USA)。試劑級甲酸 (FA) 來自安捷倫（部件號 G2453-85060）。乙酸銨和氫氧化銨購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)?；旌?DoA 標準儲備液（1 µg/mL，溶于甲醇 (MeOH) 中）來自安捷倫（部件號 5190-0470-1）。人全血樣品來自 Biological Specialty Corp. (Colmar, PA, USA)。內標 (IS) 儲備液（1 mg/mL，溶于 MeOH 或 ACN 中）購自 Cerilliant (Round Rock, TX, USA)。標樣和溶液利用混合 DoA 標準儲備液和單獨的 IS 儲備液配制標樣和 IS 加標溶液。在 20:80 甲醇/水中配制濃度為 200 ng/mL 的標樣加標溶液，用于對校準標樣和質量控制 (QC) 樣品加標。用 20:80 甲醇/水將單獨的 IS 儲備液稀釋至 2 µg/mL，制得 IS 加標溶液，并將該 IS 加標溶液直接加入樣品中。將 385.3 mg 乙酸銨溶于 1 L Milli-Q 水中，然后加入 1 mL 甲酸 (FA)，制得含 0.1% FA 的 5 mmol/L 乙酸銨緩沖液，作為流動相 A。將 1 mL FA 加入 1 L 乙腈中，制得含 0.1% FA 的乙腈溶液，作為流動相 B。將 400 µL NH4OH 加入 40 mL 預混合的 95:5 ACN/MeOH 中，新鮮配制溶于 95:5 ACN/MeOH 中的 1% 氫氧化銨 (NH4OH) 溶液。該溶液在使用前保存于 –20 °C 下。

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結論在人全血中 24 種代表性 DoA 化合物的定量測定中，對一種使用蛋白質沉淀和 Captiva EMR-Lipid 凈化產品的樣品前處理方法進行了驗證。為期三天的準確度和精度運行結果證明，該方法提供了優(yōu)異且緊湊的校準曲線線性、優(yōu)異的日內和日間準確度和精度以及可接受的分析物回收率和基質效應。Captiva EMR-Lipid 凈化產品使全血基質中的磷脂獲得了優(yōu)異的去除率。在孔內 PPT 過程中，首先加入全血樣品，然后加入沉淀溶劑，由此改善了樣品混合均勻性并促進蛋白質*沉淀。采用 96 孔板形式開發(fā)的方案適用于高通量實驗室對快速、可自動化的樣品前處理方法的需求，便捷的孔內 PPT 和 EMR-Lipid 凈化產品簡化了工作流程，同時仍可提供高效的樣品提取和基質凈化。更干凈的分析樣品還可縮短清洗儀器檢測系統(tǒng)所需的時間，改善樣品檢測通量和數(shù)據(jù)質量。