如何利用配備二極管陣列檢測(cè)器的安捷倫高效液相色譜分析吐溫 80

摘要：吐溫 80 通常用作藥物中的穩(wěn)定劑，或用于組織處理的抗鈣化劑。吐溫 80 是不均勻混合物，且缺乏良好的發(fā)色團(tuán)，定量分析具有挑戰(zhàn)性。本研究使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和 Max Plot 二極管陣列檢測(cè)器 (DAD) 開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單快速的安捷倫高效液相色譜 (HPLC) 分析方法，用于分析溶于 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液中的吐溫 80?；谕聹?80 洗脫區(qū)域中色譜峰的峰面積總和進(jìn)行定量測(cè)定。經(jīng)方法學(xué)評(píng)估，其精度、準(zhǔn)確度、線性和定量限/檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)均得到了可接受的結(jié)果。這種方法可用于對(duì)含吐溫 80 的各種水溶液進(jìn)行質(zhì)量控制和穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)。

前言：吐溫 80 也稱為聚山梨酯 80，是一種常用的非離子表面活性劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和增溶劑，廣泛用于藥物、食品、化妝品、維生素、疫苗、靜脈制劑、洗劑和肥皂中。在蛋白質(zhì)制劑中，吐溫 80 及其他聚山梨酯可大程度減小表面吸附，降低蛋白質(zhì)變性的速率，并提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性。吐溫 80 也可用于*組織制備中，戊二醛前、后組織處理（固定）的抗鈣化劑1 。鑒于這些關(guān)鍵作用，需要準(zhǔn)確定量吐溫 80 以確保產(chǎn)品質(zhì)量。吐溫 80 是脂肪酸（主要是油酸）偏酯與山梨糖醇及其酸酐乙氧基化（每摩爾山梨糖醇和山梨酸酐用 20 摩爾左右環(huán)氧乙烷進(jìn)行乙氧基化）的混合物。圖 1 示出其分子結(jié)構(gòu)。作為大分子化合物，由于混合物不均勻且缺乏紫外發(fā)色團(tuán)，因此難以對(duì)聚山梨酯進(jìn)行定量分析。文獻(xiàn)中描述了聚山梨酯 80 的幾種定量分析方法。已經(jīng)報(bào)道了基于聚山梨酯 80 化學(xué)轉(zhuǎn)化的間接方法，如堿誘導(dǎo)水解成油酸2,3。這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，包括在 40 °C 至 60 °C 的高溫下消解 6 至 18 小時(shí)。也有將 HPLC 分離與不同檢測(cè)方法（如蒸發(fā)光散射檢測(cè) (ELSD)4–6、電噴霧檢測(cè) (CAD)7 和質(zhì)譜 (MS)8 ）聯(lián)用，開(kāi)發(fā)出幾種吐溫 80 的直接分析方法。一些研究人員試圖不分離并用單一色譜峰進(jìn)行定量分析4,9。這些方法可能需要復(fù)雜的儀器，而且可能無(wú)法用于監(jiān)測(cè)吐溫 80 溶液的穩(wěn)定性。本研究介紹了一種用于測(cè)定水溶液中吐溫 80 的簡(jiǎn)單快速的方法，該方法基于 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行反相 HPLC 分離。通過(guò)測(cè)試其專屬性、線性、精度、靈敏度和準(zhǔn)確度來(lái)評(píng)估該方法用于測(cè)定磷酸鹽緩沖液中吐溫 80 的適用性。這種方法為科學(xué)家提供了一種理想選擇，因?yàn)槎O管陣列檢測(cè)器比 ELSD、CAD 和 MS 檢測(cè)器更常用于 HPLC 分析。

實(shí)驗(yàn)部分：材料和儀器吐溫 80 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自 US Pharmacopeial Convention (Rockville, MD)。利用購(gòu)自 Fisher Chemical (Fair Lawn, NJ) 的吐溫 80 配制吐溫 80 樣品。乙腈（HPLC 級(jí)）、*二水合物（經(jīng)認(rèn)證的晶體）、*二水合物（經(jīng)認(rèn)證的晶體）和磷酸 (> 85%) 購(gòu)自 Fisher Chemical。水采用 Milli-Q 水純化系統(tǒng) (Millipore, Bedford, MA) 制備得到。將 HPLC 系統(tǒng)與二極管陣列檢測(cè)器 (DAD) 聯(lián)用，對(duì)吐溫 80 樣品進(jìn)行分析。利用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 ECC18, 3.0 × 100 mm, 2.7 µm 色譜柱（部件號(hào) 695975-302A，安捷倫科技公司，加利福尼亞州圣克拉拉）來(lái)洗脫吐溫 80 峰。將 DAD 分辨率設(shè)置為 1.2 nm，在 195–400 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。采集 Max Plot 信號(hào)進(jìn)行定量分析。進(jìn)樣量為 20 µL，使用等度流動(dòng)相運(yùn)行，其中包括流動(dòng)相 A（0.1% 磷酸水溶液）和流動(dòng)相 B（0.1% 磷酸乙腈溶液），A:B 的恒定比例為 20:80。在整個(gè)分析過(guò)程中，色譜柱保持為 30 °C，流動(dòng)相流速保持為 0.4 mL/min。

結(jié)果與討論：分析的優(yōu)化文獻(xiàn)*使用幾種 HPLC 色譜柱和流動(dòng)相（如 HPLC C18 色譜柱）4 ，梯度開(kāi)始時(shí)為 70:30 的水:甲醇，在 4 分鐘時(shí)改變?yōu)樗? 甲醇 10:904 。吐溫 80 未獲得單個(gè)峰，也未*洗脫。使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和 Max Plot 二極管陣列檢測(cè)器的上述當(dāng)前條件，得到一種快速且相對(duì)簡(jiǎn)單的方法來(lái)分析磷酸鹽緩沖液中吐溫 80 的濃度通過(guò)對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處測(cè)得的大光譜吸光度繪圖，得到 Max Plot 色譜圖。Max Plot 色譜圖使分析人員能夠看到樣品中的所有色譜峰，無(wú)論 λmax（大吸光度所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)）是多少。圖 2 示出溶于 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液中的 USP 吐溫 80 標(biāo)樣的 Max Plot 色譜圖。吐溫 80 的弱紫外吸光度限制了通過(guò)固定單波長(zhǎng)來(lái)分析吐溫 80。M. Klein 等人10 使用凝膠過(guò)濾色譜 (GFC) 柱和 UV 245 nm 條件分析吐溫 80。Klein 方法的靈敏度較差。當(dāng)我們嘗試從 DAD 數(shù)據(jù)中提取 245 nm 處的色譜圖時(shí)，獲得了出人意料的色譜圖。圖 3 示出吐溫 80 樣品的 Max Plot 及其在 245 nm 處提取的色譜圖之間的比較。在 245 nm 處提取的色譜圖相比原始 Max Plot 色譜圖峰數(shù)量更少，并且 Max Plot 色譜圖中的所有峰在 245 nm 處表現(xiàn)出較弱的紫外吸光度。結(jié)果清楚地表明，Max Plot 二極管陣列檢測(cè)器更適合用于吐溫 80 分析。 Max Plot 色譜圖中的一個(gè)峰或一組峰能否用于吐溫 80 的定量分析？對(duì)由 USP 吐溫 80 標(biāo)準(zhǔn)品和 Fisher 吐溫 80 制得的濃度為 10 mg/mL 的吐溫 80 溶液的分析結(jié)果進(jìn)行比較，它們的 Max Plot 色譜圖分別如圖 2 和圖 3A 所示。即使吐溫 80 的濃度相當(dāng)（10.033 mg/mL USP 吐溫 80 和 10.145 mg/mL Fisher 吐溫 80），色譜圖在相似保留時(shí)間處仍表現(xiàn)出不同的峰強(qiáng)度。

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結(jié)論：本研究開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單快速的 HPLC 分析方法，分析溶于 0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液中的吐溫 80，該方法使用 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18 色譜柱和 Max Plot 二極管陣列檢測(cè)器 (DAD)。該方法準(zhǔn)確、精密而靈敏。如采用適當(dāng)?shù)臉悠奉A(yù)處理，較寬的校準(zhǔn)范圍可以使該方法應(yīng)用于各種水溶液（如治療性蛋白質(zhì)制劑）。此外，該方法可用于研究吐溫 80 溶液的穩(wěn)定性。