使用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析未衍生化氨基酸的方法

摘要 ：本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了一種針對(duì)未衍生化氨基酸分析優(yōu)化的方法。 氨基酸的極性使其難以進(jìn)行反相液相色譜分析。然而，親水相互作用色譜 (HILIC) 能保留并分離復(fù)雜的氨基酸混合物，同時(shí)還具有與傳統(tǒng)反相色譜類似的工作流程。 HILIC 與質(zhì)譜的組合提供了一種簡(jiǎn)單而功能強(qiáng)大的氨基酸分析解決方案。 前言 事實(shí)證明，在低 pH 與正離子模式 LC/MS 檢測(cè)條件下，采用親水相互作用色譜 (HILIC) 分離未衍生化氨基酸，能夠獲得整體靈敏度和色譜分離性能。Agilent InfinityLab Poroshell 120 2.7 µm HILIC-Z 和 HILIC-OH5 化學(xué)鍵合相為氨基酸的 LC/MS 分析提供了兩個(gè)理想選擇。二者均可對(duì)較 難分離的*/異*同質(zhì)異位素以 及多種氨基酸實(shí)現(xiàn)*分離。

 實(shí)驗(yàn)部分 ：試劑與化學(xué)品 所有試劑均為 HPLC 級(jí)或更高等級(jí)。超 LC/MS 級(jí)乙腈購(gòu)自 J.T. Baker (Center Valley, PA, U.S.A.)。水的凈化處理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系統(tǒng) (Darmstadt, Germany) 完成。試劑級(jí)甲酸（FA，部 件號(hào) G2453-85060）來自安捷倫科技公 司。甲酸銨、乙酸銨、氫氧化銨和氨基 酸標(biāo)樣購(gòu)自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。氨基酸在使用前于 –70 °C 下儲(chǔ)存。 儀器和材料 • Agilent InfinityLab 接頭 • 色譜柱前端：InfinityLab Quick Connect 快速連接液相色譜接頭 （部件號(hào) 5067-5965） • 色譜柱末端：InfinityLab Quick Turn 液相色譜接頭（部件號(hào) 5067-5966） • 安捷倫樣品瓶，螺口蓋，棕色，帶書 寫簽，經(jīng)認(rèn)證，2 mL（部件號(hào) 5182- 0716） • 安捷倫固定螺口蓋，帶 PTFE/ 紅色硅膠隔墊（部件號(hào) 5190-7024） • 安捷倫樣品瓶?jī)?nèi)插管，250 µL，去活 玻璃，帶聚合物支腳（部件號(hào) 5181- 8872） Eppendorf 移液器和連續(xù)分液器 • 渦旋器和多管渦旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) • HDPE 溶劑瓶 (VWR, Radnor, PA, USA) 儀器 • Agilent 1290 Infinity II 二元泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II 樣品瓶進(jìn)樣器 (G7129B) • Agilent 1290 Infinity II 高容量柱溫箱 (G7116B) • Agilent 1290 Infinity 液相色譜系列超 低擴(kuò)散工具包 (5067-5189) • Agilent MassHunter 工作站軟件 • Agilent 6470 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng) • 安捷倫噴射流電噴霧離子源樣品前處理 將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品與水混合至表 1 所列出 的濃度，無需進(jìn)一步樣品前處理即可直接 分析。 流動(dòng)相前處理 用水配制 200 mM 甲酸銨儲(chǔ)備液，并用 甲酸將 pH 調(diào)節(jié)至 3。將水與儲(chǔ)備液按 9:1 稀釋制得流動(dòng)相 A。將乙腈與儲(chǔ)備液 按 9:1 稀釋制得流動(dòng)相 B。兩種流動(dòng)相的 甲酸銨終濃度均為 20 mM。 流動(dòng)相與玻璃器皿過度接觸會(huì)引入離子物 質(zhì)，干擾并抑制質(zhì)譜檢測(cè)。儲(chǔ)存在玻璃瓶 中的流動(dòng)相應(yīng)定期更換，或?qū)⒉Ａ繐Q成 HDPE 瓶。

 結(jié)論 • 使用 HILIC 在正離子模式 液質(zhì)聯(lián)用LC/MS 條件 下對(duì)氨基酸實(shí)現(xiàn)了成功分析 • Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-Z 顯示出更好的總體峰形，對(duì)天冬氨酸 和*等堿性更強(qiáng)的化合物更是 如此 • Agilent InfinityLab Poroshell HILIC-OH5 對(duì)*、*和*等早洗脫 峰表現(xiàn)出更高分離度 • 這兩種色譜柱對(duì)通常難以分析的亮氨 酸/異*同質(zhì)異位素也實(shí)現(xiàn)了基 線分離