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開播時(shí)間04-22 13:48毛細(xì)管電泳概述
毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)又叫毛細(xì)管電泳(HPCE), 是近年來(lái)發(fā)展 快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm內(nèi)徑毛細(xì)管柱內(nèi)用高電壓進(jìn)行分離, 創(chuàng)立了現(xiàn)代毛細(xì)管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細(xì)管電動(dòng)力學(xué)色譜。1987年Hjerten 建立了毛細(xì)管等電聚焦, Cohen和Karger提出了毛細(xì)管凝膠電泳。1988~1989年出現(xiàn)了初始的毛細(xì)管電泳商品儀器。短短幾年內(nèi), 由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學(xué)各領(lǐng)域中對(duì)多肽、蛋白質(zhì)(包括酶,抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求, 得到了迅速的發(fā)展。
CE是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。CE和液相色譜法(HPLC)相比, 其相同處在于都是分離技術(shù), 儀器操作均可自動(dòng)化, 且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于:CE用遷移時(shí)間取代HPLC中的保留時(shí)間, CE的分析時(shí)間通常不超過(guò)30min, 比HPLC速度快;對(duì)CE而言, 從理論上推得其理論塔板高度和溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)成正比, 對(duì)擴(kuò)散系數(shù)小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多;CE所需樣品為nl級(jí), 低可達(dá)270fl, 流動(dòng)相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為μl級(jí), 流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多;但CE僅能實(shí)現(xiàn)微量制備, 而HPLC可作常量制備。
CE和普通電泳相比, 由于其采用高電場(chǎng), 因此分離速度要快得多;檢測(cè)器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外, 其它類型檢測(cè)器均已和CE實(shí)現(xiàn)了連接檢測(cè);一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近;CE操作自動(dòng)化程度比普通電泳要高得多。總之, CE的優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少:高靈敏度, 常用紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10-13~10-15mol,激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器則達(dá)10-19~10-21mol;高分辨率, 其每米理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn);高者可達(dá)幾百萬(wàn)乃至千萬(wàn), 而HPLC一般為幾千到幾萬(wàn);高速度, 快可在60s內(nèi)完成, 在250s內(nèi)分離10種蛋白質(zhì), 1.7min分離19種陽(yáng)離子, 3min內(nèi)分離30種陰離子; 樣品少, 只需nl (10-9 L)級(jí)的進(jìn)樣量;成本低, 只需少量(幾毫升)流動(dòng)相和價(jià)格低廉的毛細(xì)管。由于以上優(yōu)點(diǎn)以及分離生物大分子的能力, 使CE成為近年來(lái)發(fā)展 迅速的分離分析方法之一。當(dāng)然CE還是一種正在發(fā)展中的技術(shù), 有些理論研究和實(shí)際應(yīng)用正在進(jìn)行與開發(fā)。
“CE”統(tǒng)指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力, 以毛細(xì)管為分離通道, 依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。其儀器結(jié)構(gòu)包括一個(gè)高壓電源, 一根毛細(xì)管, 一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質(zhì)溶液中, 帶電粒子在電場(chǎng)作用下, 以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳。
CE所用的石英毛細(xì)管柱, 在pH>3情況下, 其內(nèi)表面帶負(fù)電, 和溶液接觸時(shí)形成了一雙電層。
在高電壓作用下, 雙電層中的水合陽(yáng)離子引起流體整體地朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲, 粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和, 正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致, 故先流出;中性粒子的電泳流速度為“零”,故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度;負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流方向相反, 但因電滲流速度一般都大于電泳流速度, 故它將在中性粒子之后流出, 從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。
電滲是CE中推動(dòng)流體前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力, 它使整個(gè)流體像一個(gè)塞子一樣以均勻速度向前運(yùn)動(dòng), 使整個(gè)流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)原則上不會(huì)擴(kuò)張。但在HPLC中,采用的壓力驅(qū)動(dòng)方式使柱中流體呈拋物線型, 其中心處速度是平均速度的兩倍, 導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴(kuò)張, 引起柱效下降, 使其分離效率不如CE。
理論分析表明, 增加速度是減少譜帶展寬、提率的重要途徑, 增加電場(chǎng)強(qiáng)度可以提高速度。但高場(chǎng)強(qiáng)導(dǎo)致電流增加, 引起毛細(xì)管中電解質(zhì)產(chǎn)生焦耳熱(自熱)。自熱將使流體在徑向產(chǎn)生拋物線型溫度分布, 即管軸中心溫度要比近壁處溫度高。因溶液粘度隨溫度升高呈指數(shù)下降, 溫度梯度使介質(zhì)粘度在徑向產(chǎn)生梯度, 從而影響溶質(zhì)遷移速度, 使管軸中心的溶質(zhì)分子要比近管壁的分子遷移得更快, 造成譜帶展寬, 柱效下降。
一般來(lái)說(shuō)溫度每提高1℃, 將使淌度增加2% (所謂淌度, 即指溶質(zhì)在單位時(shí)間間隔內(nèi)和單位電場(chǎng)上移動(dòng)的距離)。此外, 溫度改變使溶液pH值、粘度等發(fā)生變化, 進(jìn)一步導(dǎo)致電滲流、溶質(zhì)分子的電荷分布(包括蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu))、離子強(qiáng)度等的改變, 造成淌度改變、重復(fù)性變差、柱效下降等現(xiàn)象。降低緩沖液濃度可降低電流強(qiáng)度, 使溫差變化減小。高離子強(qiáng)度緩沖液可阻止蛋白質(zhì)吸附于管壁, 并可產(chǎn)生柱上濃度聚焦效應(yīng), 防止峰擴(kuò)張, 改善峰形。減小管徑在一定程度上緩解了由高電場(chǎng)引起的熱量積聚, 但細(xì)管徑使進(jìn)樣量減少, 造成進(jìn)樣、檢測(cè)等技術(shù)上的困難。因此, 加快散熱是減小自熱引起的溫差的重要途徑。液體的導(dǎo)熱系數(shù)要比空氣高100倍。現(xiàn)在有的采用液體冷卻方式的毛細(xì)管電泳儀可使用離子強(qiáng)度高達(dá)0.5mol/L的緩沖液進(jìn)行分離, 或使用200 μm直徑的毛細(xì)管進(jìn)行微量制備, 仍能達(dá)到良好的分離效果和重現(xiàn)性。
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