大分子組裝體的單粒子電荷檢測(cè)質(zhì)譜法

非變性質(zhì)譜是一種非常強(qiáng)大的工具，可以對(duì)兆道爾頓范圍內(nèi)的完整大分子進(jìn)行質(zhì)量的分析，從而可以確定被檢測(cè)分子的組成，翻譯后修飾以及配體等等信息。但是質(zhì)譜直接檢測(cè)的信號(hào)不是質(zhì)量，而是是質(zhì)荷比。對(duì)電噴霧電離產(chǎn)生多價(jià)態(tài)離子，常用的方法是通過價(jià)態(tài)分布中的連續(xù)譜峰進(jìn)行匹配從而確定價(jià)態(tài)，進(jìn)一步求產(chǎn)出對(duì)應(yīng)的精確分子量。但這種方式有一個(gè)局限性就是只有當(dāng)相同分子種類的多價(jià)態(tài)可以被準(zhǔn)確測(cè)定和歸屬，而這個(gè)要求對(duì)于較大的異質(zhì)蛋白復(fù)合物，例如高度糖基化，淀粉樣蛋白原纖維，包裝基因組的病毒以及含有多個(gè)脂質(zhì)分子的膜蛋白復(fù)合體來說是非常不現(xiàn)實(shí)的，在單體結(jié)構(gòu)中即使出現(xiàn)了很小的變化也會(huì)在完整復(fù)合物中出現(xiàn)廣泛的分布，這些加寬的質(zhì)量分布會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致連續(xù)價(jià)態(tài)之間的信號(hào)重疊，使得無(wú)法正確歸屬離子。

 那么如果有一種方法可以一次測(cè)量一個(gè)離子，就可以避免由于分辨率不足而導(dǎo)致的信號(hào)卷積問題，所以作者就考慮可以不可以把單離子檢測(cè)和離子電荷測(cè)定相結(jié)合，從而可以直接對(duì)單離子的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，由于原來的工作中作者已經(jīng)實(shí)現(xiàn)800 kDa GroEL復(fù)合物的單離子檢測(cè)，所以目前需要解決的就是在單離子條件下對(duì)離子電荷的測(cè)定。在orbitrap中，離子的電荷數(shù)決定了感應(yīng)電流的振幅，進(jìn)而決定了質(zhì)譜圖中輸出的相應(yīng)頻率的強(qiáng)度，而這與信號(hào)的頻率（即質(zhì)荷比）無(wú)關(guān)，所以確定信號(hào)強(qiáng)度和電荷之間的比例關(guān)系即可確定大分子質(zhì)量。作者將qinshou棚病毒顆粒樣品稀釋至納摩爾水平，進(jìn)一步縮短采樣時(shí)間至毫秒量級(jí)等方式減少離子傳輸，完成了單次掃描，可以看到雖然同時(shí)掃描到了很多離子，但是譜中存在一個(gè)非常特異的離子用于后續(xù)解析，多次采集后可以看到大多數(shù)離子的質(zhì)荷比都處于41000范圍內(nèi)，帶有大約220個(gè)電荷。為了定量確定單離子強(qiáng)度和電荷之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，作者利用了被精確測(cè)定過的質(zhì)量從150 KDa到9.4 MDa的蛋白復(fù)合物進(jìn)行單離子測(cè)定。通過每個(gè)價(jià)態(tài)200個(gè)隨機(jī)離子的采樣以及后續(xù)線性回歸模型的處理，得到了線性相關(guān)函數(shù)，且其r2為0.997。為了說明加入單電荷強(qiáng)度這一信息維度的重要性，作者對(duì)天然存在共生變體IgM進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)作者利用CD-MS去直接檢測(cè)時(shí)，可以看到有三種同時(shí)存在的不同的寡聚體信號(hào)由，但由于IgM上有多個(gè)糖基化修飾導(dǎo)致了高度的異質(zhì)性 所以對(duì)應(yīng)的峰寬且相互重疊，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行電荷分配。而進(jìn)一步加入強(qiáng)度這一維度的信息后，從而可以使用 輕度閾值對(duì)每個(gè)物種的信號(hào)進(jìn)行提取分離，進(jìn)入確定電荷以及分子量。作者后也利用新技術(shù)對(duì)空的和包裝好的腺相關(guān)病毒顆粒（AAV）在質(zhì)譜上實(shí)現(xiàn)了精確的區(qū)分。