*1測定操作步驟和注意事項

2022

07-03

09:50:02

 1982

來源：化工儀器網(wǎng)

　　*1測定操作步驟

　　1樣品制備

　　樣品采集后用勻漿機(jī)打成勻漿于低溫冰箱中冷凍保存，用時將其解凍后混勻使用。干燥樣品要將其盡量粉碎后備用。

　　2提取

　　2.1稱取一定量試樣(估計其硫胺素含量約為10~30μg，一般稱取2~10g試樣)，置于100ml三角瓶中，加入50ml0.1mol/L或0.3mol/L鹽酸使其溶解，放入高壓鍋中加熱水解121℃30min，涼后取出。

　　2.2用2mol/L乙酸鈉調(diào)其pH值為4.5(以0.04%溴甲酚綠為外指示劑)。

　　2.3按每克樣品加入20mg*和40mg蛋白酶的比例加入*和蛋白酶。于45~50℃溫箱過夜保溫(約16h)。

　　2.4涼至室溫，定容至100ml，然后混勻過濾，即為提取液。

　　3凈化

　　3.1用少許脫脂棉鋪于鹽基交換管的交換柱底部，加水將棉纖維中氣泡排出，再加約1g活性人造浮石使之達(dá)到交換柱的三分之一高度。保持鹽基交換管中液面始終高于活性人造浮石。

　　3.2用移液管加入提取液20~60ml(使通過活性人造浮石的硫胺素總量約為2~5μg)。

　　3.3加入約10ml熱蒸餾水沖洗交換柱，棄去洗液。如此重復(fù)三次。

　　3.4加入25%酸性氯化鉀(溫度為90℃左右)20ml，收集此液于25ml刻度試管內(nèi)，涼至室溫，用25%酸性氯化鉀定容至25ml，即為樣品凈化液。

　　3.5重復(fù)上述操作，將20ml硫胺素標(biāo)準(zhǔn)使用液加入鹽基交換管以代替樣品提取液，即得到標(biāo)準(zhǔn)凈化液。

　　4氧化

　　4.1將5ml樣品凈化液分別加入A、B兩個反應(yīng)瓶。

　　4.2在避光條件下將3ml15%氫氧化鈉加入反應(yīng)瓶A，將3ml堿性鐵氰化鉀溶液加入反應(yīng)瓶B，振搖約15s，然后加入10ml正丁醇；將A、B兩個反應(yīng)瓶同時用力振搖1.5min。

　　4.3重復(fù)上述操作，用標(biāo)準(zhǔn)凈化液代替樣品凈化液。

　　4.4靜置分層后吸去下層堿性溶液，加入2~3g*使溶液脫水。

　　5測定

　　5.1熒光測定條件：

　　激發(fā)波長365nm；發(fā)射波長435nm；激發(fā)波狹縫5nm；發(fā)射波狹縫5nm。

　　5.2依次測定下列熒光強(qiáng)度：

　　a.樣品空白熒光強(qiáng)度(樣品反應(yīng)瓶A)；

　　b.標(biāo)準(zhǔn)空白熒光強(qiáng)度(標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)瓶A)；

　　c.樣品熒光強(qiáng)度(樣品反應(yīng)瓶B)；

　　d.標(biāo)準(zhǔn)熒光強(qiáng)度(標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)瓶B)；

　　*1測定的注意事項

　　1、加熱酸性氯化鉀而不使其沸的原因是熱氯化鉀濾速較快，而不沸則是使其不至因過飽和而在洗滌中結(jié)晶析出阻塞交換柱。被洗下的硫胺素在酸性氯化鉀中極其穩(wěn)定，可保存一周以上。

　　2、硫胺素在堿性環(huán)境中被鐵氰化鉀氧化成噻嘧色素，振搖15s是使其充分反應(yīng)，這期間應(yīng)保證黃色不退證明鐵氰化鉀量充足不被其它還原性雜質(zhì)耗盡，而強(qiáng)堿又可破壞硫胺素，所以除加入堿性鐵氰化鉀時邊搖勻邊加入外，其加入量一定不能過多，否則硫胺素被破壞。

　　3、對每個樣品所加試劑的次序、快慢、振搖時間等都必須盡量一致，尤其是用正丁醇提取噻嘧色素時必須保證準(zhǔn)確振搖90s。

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