上海惠誠(chéng)生物提供DC細(xì)胞培養(yǎng)方案

【背景知識(shí)】

DC是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細(xì)胞”，因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、加拿大籍科學(xué)家Ralph M. Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能zui強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實(shí)，DC是wei一能夠顯著刺激初始T細(xì)胞(Naïve T cells)增殖的APC，成熟的DC可以通過(guò)Ⅱ型組織相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，而其它APC(如單核巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T細(xì)胞。DC是機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。

CIK是單個(gè)核細(xì)胞在CD3單抗和多種細(xì)胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群，其既具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。

DC-CIK (或DC+CIK)[1]是指與DC細(xì)胞共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，也可以說(shuō)，終的效應(yīng)細(xì)胞是經(jīng)DC體外活化的CIK細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達(dá)及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內(nèi)外細(xì)胞毒活性也得以增強(qiáng)，因此DC-CIK較單獨(dú)的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負(fù)載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強(qiáng)，常被用于臨床和科研。

CIK細(xì)胞和DC細(xì)胞是細(xì)胞*的2個(gè)重要組成部分，兩者聯(lián)合可確保高效的免疫反應(yīng)。

【培養(yǎng)原理】

1．DC培養(yǎng)用細(xì)胞因子：

1.1 GM-CSF(粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子)

GM-CSF是一種造血生長(zhǎng)因子，在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的集落形成，并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能。

GM-CSF是早被鑒定出來(lái)對(duì)于DC有作用的細(xì)胞因子之一。GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化，細(xì)胞表面MHC II類分子的表達(dá)得以提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF還可促進(jìn)DC的存活。

1.2 IL-4 (白細(xì)胞介素-4)

IL-4在由單核細(xì)胞誘導(dǎo)成DC的過(guò)程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì)胞。同時(shí)，IL-4還有降低細(xì)胞表面表達(dá)CD14分子的能力。CD14表達(dá)水平的降低是單核細(xì)胞分化為DC的重要標(biāo)志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC(immature DC)，此時(shí)的DC具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá)MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表達(dá)CD14。

1.3 TNF-α (腫瘤壞死因子-α)

TNF-α可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)MHC II類分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面 MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表達(dá)，使未成熟DC分化為成熟DC(mature DC)，此時(shí)DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可*的激活T細(xì)胞。

【細(xì)胞制備】

1．外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集

1.1用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞80-100mL；

1.2淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；

1.3無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的 PBMC，細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到1-3x10⁸。 

2. DC 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

2.1 步驟1中獲得的PBMC用無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2 x 10^6/ml，置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

2.2 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細(xì)胞貼壁；

2.3 吸去懸浮的細(xì)胞，剩下的貼壁細(xì)胞(主要是 CD14+的單核細(xì)胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1,000U/ml和重組人IL-4 500U/ml的無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC細(xì)胞分化；

3.2 每3d半量換液一次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子；

3.3在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-a(500U/ml)，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；

3.4在培養(yǎng)的第7d或第8d，收獲DC細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×10^6個(gè)以上；

3.5 DC的質(zhì)檢：

3.5.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在80%以上；

3.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表達(dá)，以確定DC 是否成熟。

4.收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測(cè)陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。

【*試劑】

【其它相關(guān)試劑】