探索ACE C18-AR的優(yōu)勢

• 為“標(biāo)準(zhǔn)”C18色譜柱提供了替代選擇性，額外*用于具有芳香族官能團(tuán)的化合物
• 超惰性、超高純度硅膠，具有的峰形和可重現(xiàn)性
• 與高水含量的流動相兼容，以保留和分離極性化合物
• 為高溫應(yīng)用提供的鍵合相穩(wěn)定性
• 超低流失相可以確保UV和LC/MS的兼容性
• 可獲得高通量色譜柱尺寸

為什么需要另一種新的C18相？
使用超純、超惰性硅膠具有許多*的優(yōu)點，包括改善可重現(xiàn)性、壽命和色譜性能（特別是堿性分子）。

然而，由于超惰性硅膠表面不再有效促進(jìn)分離，所以用高純度硅膠制造的C18柱可以顯示出接近相同的選擇性。

因此，通過改用替代制造商的同等產(chǎn)品，一個帶頭品牌的問題分離很可能不會得到顯著改善。
多年來，經(jīng)驗豐富的色譜學(xué)家們一直在尋求由這樣帶頭的C18色譜柱品牌展示的、具有可靠性能和可重現(xiàn)性優(yōu)點的相，但另外也為他們的挑戰(zhàn)性應(yīng)用提供了所需的替代選擇性。

ACE C18-AR有何不同？

C18鍵合相目前主導(dǎo)著HPLC市場，近的調(diào)查顯示，它們?nèi)匀徽紦?jù)了所有HPLC色譜柱銷售量的50-60％。

然而，近年來，由于它們提供的替代選擇性，苯基鍵合相的使用顯著增長。

據(jù)估計，苯基相目前占HPLC色譜柱銷售量的10-15％，其它成為C18相之后的大子類別。

ACE C18-AR色譜柱采用了特殊開發(fā)的配體，將C18鏈與完整苯基官能團(tuán)結(jié)合在一起，從而將C18和苯基特征的優(yōu)點結(jié)合到單個相中。

基于與ACE C18相同的超惰性、超純、超可重現(xiàn)性的硅膠平臺，和*的ACE C18-AR色譜柱為C18柱提供了替代選擇性。

ACE C18-AR顯示出對C18鍵合色譜柱的替代選擇性

“我們需要一個C18相來提供不同的色譜分析和改善的分離度- 所提供的ACE C18-AR” 某制藥公司的高級分析師

何時應(yīng)用ACE C18-AR？
由于其相似的疏水特性，ACE C18-AR色譜柱可用于通常會考慮“標(biāo)準(zhǔn)”C18色譜柱的應(yīng)用中。

然而，由于其完整的苯基官能團(tuán)，ACE C18-AR還被*用于涉及含有芳香族官能團(tuán)的化合物的分離。
本手冊中包含的應(yīng)用證實，ACE C18-AR可用于改善C18色譜柱上存在問題的分離。

*的ACE C18-AR相為C18色譜柱提供了替代選擇性，但對規(guī)定為C18鍵合色譜柱的方法，保留了有效的選擇。

在許多情況下，證實不適合C18色譜柱的相同評估條件被證實適用于C18-AR色譜柱，這就避免了冗長的方法再開發(fā)。

應(yīng)用#1 - *

樣品：1）吡哆醇2）對氨基苯甲酸3）泛酸4）*5）氰鈷胺素6）d-*7）核黃素 色譜柱尺寸：150 x 4.6mm 流速：1.50ml/min 流動相：A) 20mM KH2PO4 (pH 2.8) B) 20mM KH2PO4 (pH 2.8)（溶于50:50 v/v甲醇/水中） 線性梯度：在15分鐘內(nèi)20%-70% B 溫度：40°C 檢測：UV, 205nm

含有*的該測試闡明，帶頭的C18色譜柱品牌可以提供類似的選擇性。

優(yōu)化溫度和梯度后，在ACE C18上實現(xiàn)了可接受的分離，關(guān)鍵對2，3僅基線分離。

為了提高方法的耐用性，*嘗試并進(jìn)一步改善分離度。由于評估條件已經(jīng)蕞佳，我們現(xiàn)在研究改用另一種C18色譜柱品牌是否可以改善我們的關(guān)鍵對（峰2、3和5、6）的分離。

這種方法代表了目前在許多實驗室中開展的方法開發(fā)策略。
如上述結(jié)果所示，Zorbax XDB C18和Sunfire C18色譜柱不再分離關(guān)鍵對2、3，而Luna C18（2）色譜柱顯示關(guān)鍵對2、3的分離度略有改善，但當(dāng)前關(guān)鍵對5、6 僅得到了部分分離。
然而，*的ACE C18-AR相可以提供與帶頭的C18色譜柱品牌*不同的分離度。

兩個關(guān)鍵對的分離度得到顯著改善，方法的耐用性也不再是問題。

實際上，現(xiàn)在可以進(jìn)一步優(yōu)化色譜柱尺寸和評估條件（以減少分析時間）。

ACE C18-AR色譜柱為“標(biāo)準(zhǔn)”C18色譜柱提供了替代選擇性，*用于具有芳香族官能團(tuán)的化合物

應(yīng)用#2 - 芳香硝基苯類

樣品：1）1,3,5-三硝基苯2）1,3-二硝基苯3）硝基苯4）中性分子（參考） 流動相：50:50 v/v甲醇/水 色譜柱尺寸：150 x 4.6mm 流速：1.00ml/min 溫度：40°C 檢測：UV, 210nm

在簡單的等度條件下所開展的包含芳香族硝基苯化合物的測試再次顯示，帶頭的C18色譜柱品牌可以提供近乎相同的選擇性。

保留值的差異（如中性參考標(biāo)記所示）是由于純粹的疏水作用并與母體硅膠特性（例如：表面積）相關(guān)。

如上述ACE C18-AR色譜柱所示，中性標(biāo)記的疏水保留值與其C18相當(dāng)，但對芳香族硝基苯化合物的選擇性顯著增強- 保留增加和洗脫順序*相反。

該保留*不同于用標(biāo)準(zhǔn)C18相所得結(jié)果，是由包含在ACE C18-AR色譜柱配體中的完整苯基官能團(tuán)造成的。

色譜柱惰性比較

• 的3μm、小孔徑C18色譜柱品牌
• 50 x 2.1mm i.d.LC/MS兼容尺寸
• 堿性分子惰性測試
• 峰柱效和不對稱性研究

峰柱效比較

色譜柱尺寸：50 x 2.1mm 樣品：1）*2）吡啶3）* 流動相：40:60 v/v甲醇/水 流速：0.20ml/min 溫度：22°C 波長：254nm

結(jié)論：
當(dāng)分析吡啶（一種高堿性小分子）時，可以看到柱效、峰形和選擇性的顯著差異。
拖尾和保留增加表明，吡啶和固定相表面上的硅醇基之間存在不受歡迎的次級相互作用。

這些相互作用也可能導(dǎo)致色譜柱可重現(xiàn)性不佳。
之前已對ACE C18色譜柱進(jìn)行了獨立測試，發(fā)現(xiàn)具有出色的柱效和級致的惰性。

新型ACE C18-AR色譜柱保持了這一優(yōu)異性能。

ACE® 固定相幾乎消除了硅醇對UHPLC和HPLC分離的不利影響

ACE C18-AR色譜柱與高水含量的流動相兼容，以保留和分離極性化合物

兼容高水含量的流動相
雖然主要設(shè)計是顯示對“標(biāo)準(zhǔn)”C18色譜柱的替代選擇性，但ACE C18-AR色譜柱也可在100％水性流動相中防止保留損失，并且可在快速梯度中使用，其中快速再平衡和防止保留損失至關(guān)重要。

高水含量條件下的大可重現(xiàn)性
當(dāng)分離強極性的水溶性化合物時，通常需要高水含量（> 95％）的流動相來達(dá)到足夠的保留。

然而，在該條件下操作常規(guī)C18色譜柱可能會導(dǎo)致色譜分析的可重現(xiàn)性不佳。

隨著時間的推移，色譜峰將以越來越短的保留時間被洗脫，色譜峰之間的分離度將越差。
該保留損失初被認(rèn)為是由于“固定相塌陷”，由此鍵合相配位體逐漸擠成一團(tuán)，從而與樣品的相互作用降低。

然而，近的研究表明，實際上正在發(fā)生“孔脫濕”。

流動相可在高水含量條件下從孔中被排擠出來，并且保留損失是由接觸表面積的損失所致。
ACE C18-AR色譜柱的完整苯基官能團(tuán)可防止孔脫濕和隨后的保留損失，即使在高水含量的條件下也能實現(xiàn)高度可重現(xiàn)性的色譜分析。

100％水性流動相的可重現(xiàn)性色譜分析

用于色譜分析的超惰性硅膠
設(shè)計用于高水含量條件下的許多色譜柱受所使用的低純度硅膠的影響，并且極性堿性分子所呈現(xiàn)的峰形不佳。

這導(dǎo)致色譜分析不佳，并終導(dǎo)致色譜柱的可重現(xiàn)性不佳。
ACE C18-AR色譜柱由與所有ACE相相同的超惰性、高純度硅膠制造，以確保獲得優(yōu)異的色譜分析和可重現(xiàn)性。

優(yōu)秀的競品比較- 親水基

樣品：1）尼古丁2）芐胺3）普魯卡因胺4）*5）* 流動相：3.3:96.7甲醇/20mM KH2PO4 (pH 2.7) 尺寸：150 x 4.6mm i.d. 流速：1.0ml/min, 溫度：60°C， 波長：210nm

Zorbax SB-Aq色譜柱顯示峰1和3的性能顯著損失，而超惰性ACE C18-AR色譜柱保持的親水基峰形。

應(yīng)用#3 - 含硫化合物

樣品：1）甲基苯基亞砜2）甲基苯基砜3）甲苯4）茴香硫醚 流動相：A) 水B)甲醇T = 0 mins; 30% B; T = 5.0 mins, 30% B; T = 9.0 mins, 95% B 色譜柱尺寸：50 x 2.1mm 流速：0.50ml/min 溫度：22°C 檢測：UV, 254nm

含硫化合物的高難度分離再次表明，優(yōu)秀的C18柱品牌提供基本相同的分離，同時獲得兩對共洗脫峰。
然而，C18-AR色譜柱提供的分離再次與優(yōu)秀的C18色譜柱品牌*不同。

由ACE C18-AR色譜柱提供的附加芳香族（π-π）相互作用使得關(guān)鍵對1、2和3、4*分離。

ACE C18-AR色譜柱為高溫應(yīng)用提供的鍵合相穩(wěn)定性

溫度和pH穩(wěn)定性
在低pH值時，色譜柱退化是由鍵合相的水解所致，同時觀察到保留值降低。

鍵合相的性質(zhì)、硅膠表面的純度和鍵合密度都是關(guān)鍵參數(shù)。

使用較低純度的硅膠、較短的配體和較低的鍵合密度都是有助于加速配體斷裂和降低柱壽命的因素。

酸性暴露條件： 流動相： 5:95 甲醇/0.1％TFA（溶于水中）（pH 1.9） 色譜柱尺寸：50 x 2.1mm 流速： 0.20ml/min 0.20ml/min 溫度： 80°C

使用設(shè)計用于加速柱降解的條件，ACE C18-AR色譜柱顯示保留損失極低，其壽命與高度穩(wěn)定的ACE C18色譜柱相當(dāng)。

兩相均采用相同的超純硅膠制造，并且這兩種固定相比Zorbax SB C18耐久性更好（Zorbax SB C18是一種之前被認(rèn)可的、可在高溫和低pH應(yīng)用中提供出色穩(wěn)定性的固定相）。
正如預(yù)期，基于低純度硅膠（Waters Spherisorb ODS2）的C18鍵合色譜柱在這些加速條件下顯示壽命大大降低。
特別值得注意的是優(yōu)秀的苯基色譜柱與ACE C18-AR色譜柱之間的壽命比較結(jié)果。

盡管使用了超純硅膠，但與ACE C18-AR色譜柱相比，苯基色譜柱的使用壽命降低，這表明ACE C18-AR色譜柱可能適用于常規(guī)苯基色譜柱呈現(xiàn)壽命降低的應(yīng)用。

應(yīng)用#4 - 鎮(zhèn)痛劑分離

化合物：1）4-乙酰氨基*2）4-氨基苯甲酸3）4-羥基苯甲酸4）咖啡茵5）2-乙酰氨基*6）3-羥基苯甲酸7）水楊酰胺8）乙酰苯胺9）* 10）乙酰水楊酸11）苯甲酸12）山梨酸13）水楊酸14）phenylacetin 15）氺楊醛 色譜柱尺寸：150 x 4.6mm 流速：1.00ml/min 溫度：40°C 檢測：UV, 240nm 流動相： A. 0.1% v/v甲酸（溶于水中） B. 0.1% v/v甲酸（溶于乙腈中） 梯度： 時間（分鐘） %B                   0             5                   9             35

上述應(yīng)用顯示在ACE C18色譜柱上分離鎮(zhèn)痛劑時，可以觀察到4對共洗脫峰。

該分離也與其他優(yōu)秀的C18柱品牌可以預(yù)期的結(jié)果相同，由于相同（主要是疏水性）的相互作用，它們顯示選擇性極為相似。
基于與ACE C18相同的超惰性、超高純度硅膠平臺，和*的ACE C18-AR相可以提供替代選擇性來使所有15種組分分離，包括之前確定的4個關(guān)鍵對。

經(jīng)發(fā)現(xiàn)，證實不適合ACE C18的相同評估條件可以適用于ACE C18-AR柱，這就避免了冗長的方法再開發(fā)。

ACE C18-AR色譜柱有保證的可重現(xiàn)性和*可擴(kuò)展性

與替代選擇性同等重要的是的可重現(xiàn)性。

固定相的不同批次之間的變化是客戶關(guān)注的常見原因。

ACE固定相通過保持對整個制造過程的嚴(yán)格控制并建立純度、選擇性、保留、柱效和不對稱性的嚴(yán)格規(guī)范，幾乎*消除硅醇基對HPLC分離的不可預(yù)測的不利影響。

因此，如下圖所示，所有ACE C18-AR色譜柱均可以保證批次間和柱間的可重現(xiàn)性。

色譜柱：ACE 5 C18-AR, 150 x 4.6mm（除非另有說明） 樣品：1）*2）4-羥基苯甲酸3）乙酰水楊酸4）苯甲酸5）2-羥基苯甲酸6）對羥基笨甲酸乙酯 流動相：35:65乙腈/0.1%TFA（溶于水中） 溫度：22°C 波長：254nm 流速：1.00ml/min

將可用的3μm、5μm和10μm粒徑與從毛細(xì)管到制備規(guī)模的一系列柱尺寸相結(jié)合，可確保方法可重現(xiàn)地放大或縮小。上述色譜圖顯示，當(dāng)硅膠批次和硅烷批次改變時可以獲得的可重現(xiàn)性，并當(dāng)粒徑和柱直徑改變時可以獲得可重現(xiàn)的可擴(kuò)展性。

為了獲得蕞佳色譜柱壽命，*使用2-8的pH范圍。

為了在高pH值下增加色譜柱壽命，必須考慮有機(jī)緩沖液、低緩沖液濃度、高%有機(jī)溶劑和低溫。

應(yīng)用:

Analgesic Separation

  ACE C18-AR色譜柱超低流失相可以確保UV和LC/MS的兼容性

許多相顯示有鍵合相的流失，當(dāng)基線穩(wěn)定性受到影響時，這可以在梯度條件下被清晰地觀察到。

盡管大多數(shù)超純C18相可以預(yù)期產(chǎn)生低柱流失，但是需要謹(jǐn)慎選擇替代選擇性的鍵合相，以確保在低UV波長或LC/MS下進(jìn)行分析時柱流失不會引起不可預(yù)見的問題。

ACE C18-AR顯示UV下的低柱流失

色譜柱尺寸：150 x 4.6mm 流速：1.00ml/min 溫度：60°C 檢測：UV, 214nm 梯度：時間（分鐘） %B                0              5                20          95                25          95               26             5 流動相： A. 20mM KH2PO4（溶于水中）(pH 2.7) B. 35:65 (v/v) 20mM KH2PO4（溶于水中）(pH 2.7) /甲醇 化合物：1）尼古丁2）芐胺3）普魯卡因胺4）特布他林5）*6）*7）內(nèi)標(biāo)A 8）內(nèi)標(biāo)B 9）苯海拉明10）去甲替林

ACE C18-AR 色譜柱 

本實例對超純ACE C18色譜柱（頂部）的低流失特性與苯基色譜柱（中間）的中等流失特性進(jìn)行了比較。

ACE C18-AR色譜柱（底部）顯示其流失水平與ACE C18相當(dāng)，盡管后者包含可以提供替代選擇性的完整苯基官能團(tuán)。

ACE C18-AR 色譜柱 

UV流失的比較

優(yōu)秀的C18品牌和普通替代鍵合相的評估

在相同條件下對更寬范圍的色譜柱的進(jìn)一步分析證實，優(yōu)秀的高純度C18柱品牌顯示出相似的低水平色譜柱流失。

然而，傳統(tǒng)上*改變選擇性的替代鍵合相（即苯基，極性嵌入式，PFP和AQ型表面化學(xué)物質(zhì)）的評估顯示，所有這些非C18色譜柱均有顯著更高的流失。
ACE C18-AR將低流失水平（典型的優(yōu)秀C18色譜柱品牌）與替代選擇性相結(jié)合，從而為分析者提供了有價值的方法開發(fā)工具。

當(dāng)采用MS檢測時，非C18相給分析者帶來了傳統(tǒng)上使用所出現(xiàn)的額外挑戰(zhàn)。

在情況下，柱流失可能會污染檢測器信號并掩蓋重要分析物。
在以下實例中，在梯度運行的18-25分鐘時段中監(jiān)測柱流失，此時有機(jī)物的百分比增加至其大水平，因此柱流失也是高的。

MS Spectra（左邊系列）提供了在該18-25分鐘窗口中檢測到流失的m/z裂解，而總離子色譜圖（右邊系列）闡明了在相同18-25分鐘時間段內(nèi)所獲得的流失結(jié)果。

ACE C18-AR顯示LC/MS下的低柱流失

色譜柱尺寸：150 x 3.0mm 流速：0.43ml/min 溫度：60°C 檢測：+ ve ESI模式（ThermoFisher Deca LCQ離子阱），全掃描范圍50 - 1500m/z 流動相： A. 0.1% v/v甲酸（溶于水中） B. 0.1% v/v甲酸（溶于乙腈中） 梯度： 時間（分鐘） %B                    0            5                   20          90                   25          90                   26           5

通過LC/MS分析，極性嵌入式色譜柱的TIC追蹤和MS光譜（之前通過UV檢測顯示有顯著流失）再次顯示柱流失水平較高。

來自空白運行（在沒有連接色譜柱的情況下開展）的MS光譜可以使背景系統(tǒng)流失量化。

ACE C18-AR色譜柱和優(yōu)秀的C18色譜柱均顯示與空白運行相似的流失水平，這表明正在發(fā)生的柱流失可以忽略。

結(jié)論：
ACE C18-AR相可用于為優(yōu)秀的C18色譜柱提供不同的選擇性，同時不會遇到與許多替代（即非C18）鍵合相相關(guān)的柱流失問題。

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