Nanofilm體積排阻（SEC）固定相是以高純度具有良好機械穩(wěn)定性的硅膠為基質(zhì)，表面化學鍵合有一層均一、親水、納米厚度的中性聚合物薄膜。 該固定相的一個特點是可使用低鹽濃度，或含有機溶劑的緩沖液作為流動相進行生物樣品的分離，并具有高的分辨率和樣品回收率。該色譜填料為窄粒徑分布的球形 硅膠顆粒?？讖揭?guī)格有150、250、450和950Å。
不同規(guī)格Nanfilm SEC固定相的特征參數(shù)
固定相 | Nanofilm SEC-150 | Nanofilm SEC-250 | Nanofilm SEC-500 | Nanofilm SEC-1000 |
材料 | 納米親水鍵合薄膜 | 納米親水鍵合薄膜 | 納米親水鍵合薄膜 | 納米親水鍵合薄膜 |
粒徑 | 5、10µm | 5、10µm | 5、10µm | 5、10µm |
孔徑(Å) | ~ 150 | ~ 250 | ~ 500 | ~ 1,000 |
蛋白分子量范圍 | 200 - 750,000 | 1,500 - 1,250,000 | 15,000 - 2,500,000 | 50,000 - 5,000,000 |
pH穩(wěn)定性 | 2 - 8.5 | 2 - 8.5 | 2 - 8.5 | 2 - 8.5 |
反壓(psi, 以4.6mm I.D.×300mm計) | ~ 700 | ~ 700 | ~ 750 | ~ 750 |
耐受壓力(psi) | ~ 3,500 | ~3,500 | ~ 3,000 | ~ 3,000 |
鹽濃度范圍 | 20mM - 2.0M | 20mM - 2.0M | 20mM - 2.0M | 20mM - 2.0M |
耐受溫度(°C) | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 |
● 高的分辨率和分離效率
● 在高濃度鹽溶液中非常穩(wěn)定
● 高的重復(fù)性
● 可在低濃度鹽溶液中進行蛋白的分離
● 高的蛋白回收率，并可保持其生物活性
● pH適用范圍2-9
高效分離
對于生物分離而言，生物分子與填料之間的非特異性相互作用往 往會導致低的分離效率，如色譜峰拖尾以及低的回收率等。Nanofilm SEC填料所采用的*的表面化學技術(shù)可以在硅膠表面共價鍵合一層均勻的聚合物鏈。這種固定相具有中性和親水的性質(zhì)，因此可以zui大限度消除填料基質(zhì)與生物 分子，其中尤其是與蛋白之間的非特異性相互作用。這種經(jīng)過特別設(shè)計的涂層可以使Nanofilm SEC柱獲得高的分辨率和分離效率。例如，以*作為測試物可以獲得高達每米90,000的理論塔板數(shù)（見表1）。
表1 Nanofilm SEC柱的柱效，以*為待測物（0.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.0）
Nanofilm SEC-150 | >90,000 塔板/米 |
Nanofilm SEC-250 | >90,000 塔板/米 |
Nanofilm SEC-500 | >85,000 塔板/米 |
Nanofilm SEC-1000 | >85,000 塔板/米 |
標準蛋白分離
賽分Nanofilm SEC柱高效分離的*個例子見圖1。四種蛋白質(zhì)，甲狀腺球蛋白、BSA二聚體、BSA和*，以及一種多肽在Nanofilm SEC柱上得到了滿意的分離。以*計得到的理論塔板數(shù)高至30,000/m，因此*中的一種雜質(zhì)都可以得到很好的分離，而這種分離效果通常只有在 高效毛細管電泳中才看得到。SEC柱的標準測試樣品通常為Biorad 標準蛋白（甲狀腺球蛋白、免疫球蛋白G 、卵清蛋白、肌球素）。這些蛋白質(zhì)的pI均小于7.5，因此在pH=7.0時不會帶有明顯的正電荷。但是高度帶正電荷的蛋白質(zhì)，如*（pI 11.0）、細胞色素（pI 10.6）、*（pI 11.0）卻容易與填料表面的殘余硅羥基發(fā)生強靜電相互作用而非常難被洗脫。Nanofilm SEC柱不存在這個問題。而且，賽分公司建立了自己的蛋白測試標準樣品，其中就包括了對生物分離性能非常敏感的*。
圖1 在4.6mm I.D.×250mm Nanofilm SEC-150柱上分離4種蛋白和一個多肽。
BSA與BSA二聚體的分離
從圖2可以看到，Nanofilm SEC-250柱（4.6mm I.D.×300mm），可以獲得牛血清白蛋白（BSA）和BSA雙聚體的分離，其中流動相為150mM的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。
甲狀腺球蛋白中聚合體的分離
甲狀腺球蛋白是一個大分子量蛋白（MW 670,000）。商品化的甲狀腺球蛋白含有聚合體雜質(zhì)，可能是雙聚體或四聚體。從圖3可以看到，Nanofilm SEC-500可以對甲狀腺球蛋白和甲狀腺球蛋白聚合體實現(xiàn)基線分離。
圖3 用Nanofilm SEC-500柱（5µm, 4.6mm I.D.×300mm）從甲狀腺球蛋白中分離出聚合體。
色譜條件: 流動相，150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；流速，0.35mL/min；檢測波長，UV 214nm；溫度，室溫（23°C）；進樣體積，5µL。蛋白樣品：（1）聚合體；（2）甲狀腺球蛋白（1.0mg/mL），670kD。
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孔結(jié)構(gòu)對分離的影響
SEC填料孔徑的大小在蛋白分離中起到至關(guān)重要的作用。對于在某一特定分子量范圍內(nèi)分布的蛋白樣品而言，Nanofilm SEC固定相規(guī)格的選擇需要基于填料的排除極限和線性分子量范圍這兩個參數(shù)。
Nanofilm填料 | 蛋白的分子量排除極限 |
SEC-150 | 750,000 |
SEC-250 | 1,250,000 |
SEC-500 | 2,500,000 |
SEC-1000 | 5,000,000 |
圖4 Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500柱（5µm, 7.8mm I.D.×300mm）分離效果的比較。 | |
色譜條件： 流動相，150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；
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圖4為具有不同孔徑的Nanofilm SEC柱對分子量在120-670,000之間分布的三種蛋白的分離，從中可以看到Nanofilm SEC填料孔徑的不同對分離的影響。
高的蛋白回收率及蛋白活性的保持
Nanofilm SEC填料是在硅膠表面zui大限度地共價鍵合一層親水的中性薄膜。蛋白或其它生物分子與這種填料的相互作用非常小。因此，蛋白在硅膠表面的吸附將會被抑制， 這就保證了高的回收率，并可使蛋白在分離之后依然有著高的生物活性。表2是實驗測得的酸性蛋白BSA和堿性蛋白*的回收率數(shù)據(jù)。
表2 蛋白在Nanofilm SEC柱上的回收率（色譜柱規(guī)格4.6mm I.D.×250mm，流動相為0.15M磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）
固定相 | 蛋白回收率% | |
Nanofilm SEC-150 | BSA | >95% |
* | >90% | |
Nanofilm SEC-250 | BSA | >95% |
* | >90% | |
Nanofilm SEC-500 | BSA | >95% |
* | >95% | |
Nanofilm SEC-1000 | BSA | >95% |
* | >95% | |
Nanofilm SEC固定相的高穩(wěn)定性
Nanofilm SEC固定相具有致密的涂層鍵合密度，因此可阻止任意分子破壞硅膠與固定相之間的鍵合，從而保證填料具有高的穩(wěn)定性。Nanofilm SEC固定相可用于多種緩沖液中，如醋酸銨、磷酸鹽、Tris等。當用150和100mM的磷酸緩沖液（pH7.0）作為流動相時，在3個月或進樣 1000次后Nanofilm SEC柱的性能僅會發(fā)生輕微的改變，保留時間的偏差在5%以內(nèi)。圖5是Nanofilm SEC-150在1、5和10天，每天運行10小時得到的結(jié)果。從圖中可以看到流出曲線基本重合。圖6是兩周內(nèi)蛋白和一個小分子在500倍柱體積內(nèi)保留時 間的變化情況。從圖中可以看到保留時間變化的差異非常小。 Nanofilm SEC固定相可在高鹽濃度，如1.0M下使用。另外，Nanofilm SEC柱在有機溶劑如甲醇、乙醇、THF、DMF、DMSO等中，以及其與水的混和溶液中也相當穩(wěn)定。 Nanofilm SEC柱在pH 2-8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定。另外，在短時間內(nèi)也可以耐受高的pH，如pH 8.5-10。 Nanofilm SEC柱在溫度耐受方面表現(xiàn)突出。zui高工作溫度可達到80°C。
圖5 Nanofilm SEC固定相穩(wěn)定性實驗結(jié)果 | |
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色譜條件： 色 譜柱，Nanofilm SEC-150(5µm, 4.6mm I.D.×300mm)；流動相，150mM和100mM磷酸鹽緩沖液, pH 7.0；流速，0.35mL/min；溫度，室溫；進樣體積，10µL。樣品：1. 甲狀腺球蛋白(1.0mg/mL)；2. BSA (1.0mg/mL)；3. 核糖核酸酶A(1.0mg/mL)；4. *(50mg/mL)。每天運行10小時。 | |
圖6 三種蛋白和*在500倍柱體積內(nèi)反復(fù)進樣得到的保留時間的變化情況。測試條件同上圖。 |
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蛋白分子量的校正
對于SEC而言，填料孔徑的大小決定了所能分離的分子量范圍，而孔體積則決定了分離容量。Nanofilm填料擁有4種孔徑規(guī)格，可以覆蓋一個寬范圍分子 量分布的生物大分子。圖7是Nanofilm SEC-150、Nanofilm SEC-250和Nanofilm SEC-500的蛋白分子量校正曲線。
圖7 Nanofilm SEC柱的蛋白分子量校正曲線圖。色譜條件：色譜柱4.6mm I.D.´300mm, 填料粒徑為5µm；流動相為150mM磷酸鹽緩沖液, pH 7.0；流速為0.25mL/min；檢測波長為214nm；進樣體積為5µL。樣品為: 1. 甲狀腺球狀蛋白(670kD), 2. IgG(150kD), 3. BSA雙聚體(132kD), 4. BSA (66kD), 5. 卵清蛋白(44kD), 6. 肌紅蛋白(17.6kD), 7. *(14.3kD), 8. B12 (1.35kD), 9. *(120D)。
另一種廣泛使用的表征SEC固定相的方法是以蛋白的分子量對擴散系數(shù)（Kd）作圖。Kd按下式定義： Kd = (Ve-Vo)/(VT-Vo) 其中Ve、VT和Vo分別是樣品洗脫體積，色譜柱的總體積和柱的死體積。蛋白分子量和Kd的線性區(qū)間經(jīng)常會被作為SEC固定相選擇的參考。如圖8所示，Nanofilm SEC-150在一個寬的分子量范圍內(nèi)分子量和Kd之間有著良好的線性關(guān)系。
圖8 Nanofilm SEC-150的蛋白分子量校正曲線。色譜柱：Nanofilm SEC-150 (4.6mm I.D.×150mm, 5µm)；流動相：100mM磷酸緩沖液，pH 7.0；流速：0.25mL/min；檢測波長：UV 214nm；溫度：室溫（23°C）；進樣體積，5µL。樣品：（1） 甲狀腺球蛋白（670KD）；（2） IgG（150KD）；（3）BSA雙聚體（132KD）；（4 ）BSA（66KD）；（5）卵清蛋白（44KD）；（6）a-*（25KD）；（7）肌紅蛋白（17.6kD）；（8）* （14.3kD）；（9）多肽樣品（1.5kD）；（10）*（120D）。
低鹽濃度下蛋白的分離
對于帶正電荷蛋白的分離，往往需要用高鹽濃度來減弱硅膠基質(zhì)與蛋白之間的強靜電相互作用。比如*是一種富含正電荷的蛋白質(zhì)（pI=9.6），因此 很難在低鹽濃度（比如50mM磷酸鹽緩沖液， pH 7.0）下被洗脫出來。使用高鹽濃度洗脫會限制SEC柱在蛋白分離中的應(yīng)用。賽分公司所開發(fā)的Nanofilm SEC柱可以有效地分離帶正電荷的蛋白質(zhì)。如圖9所示，采用Nanofilm SEC-500柱，*可以在50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中得到很好的分離，而這種分離效果是其它硅膠基質(zhì)SEC柱所無法實現(xiàn)的。Nanofilm SEC柱的出現(xiàn)為SEC開拓了許多新的應(yīng)用領(lǐng)域，例如分離對鹽敏感的生物分子，蛋白相互作用的研究，以及LC/MS檢測等。
圖9 *在不同磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中的流出曲線。 色譜柱：Nanofilm SEC-250柱(5µm, 4.6mm I.D.×300mm)； |  |
SRT SEC和Nanofilm SEC的比較
與Nanofilm SEC相比，SRT SEC具有更高的分離容量和分辨率，可供選擇的孔徑規(guī)格也要比前者多。但是，Nanofilm SEC在一些應(yīng)用，如使用低鹽濃度或含可揮發(fā)性鹽的有機溶劑作為流動相進行富含正電荷生物分子的分離，多維色譜分離，以及LC/MS等中表現(xiàn)得更為穩(wěn)定， 而這是傳統(tǒng)SEC固定相所無法實現(xiàn)的。另外，SRT和Nanofilm SEC固定相也具有不同的選擇性。SRT和Nanofilm SEC固定相可以組合起來使用，從而可為生物分子，水溶性聚合物，病毒和細菌，以及納米顆粒等的分離提供一個完整的分離方案。
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