非洲綠腎人胚膀胱組織來源細胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時,細胞質回縮,胞體呈圓球形.然后細胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類,培養(yǎng)基成分,載體的理化性質等密切相關。一般情況下,原代培養(yǎng)細胞貼壁速度慢,可達0-24 小時或更多,而傳代細胞系貼壁速度快,通常0-30 分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期.原代培養(yǎng)細胞潛伏期,約24-96 小時或更長,連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅需6-24 小時。
細胞指數(shù)增生期(logarithmic growth phase) 這是細胞增殖zui旺盛的階段,分裂相細胞增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(shù)(Mitotic index,MI)表示,即細胞群中每000 個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.%-0.5%,原 代細胞分裂指數(shù)較低,而連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂相指數(shù)可高達3%-5%。非洲綠腎指數(shù)增生期的細胞是細胞活力時期,是進行各種實驗*時期,也是凍存細胞的時機。在接種細胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3-5 天后,隨著細胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少,zui后細胞相互接觸匯合成片。
正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動,這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現(xiàn)象,能繼續(xù)移動和增殖,導致細胞向三維空間擴展,使細胞發(fā)生堆積(piled up)。細胞接觸匯合成片后,雖然發(fā)生接觸抑制,但只要營養(yǎng)充分,細胞仍能進行增殖分裂,因此細胞數(shù)仍然在增多。但是,當細胞密度進一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產物增多時,細胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產物的影響,導致細胞分裂停止,這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象(Density Inhibition)。
培養(yǎng)細胞注意事項:
實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌,以70%ethanol擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風扇運轉0分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉0分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。
無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之無菌區(qū)域,勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少ClassⅡ)。操作過程中,應避免引起aerosol之產生,小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等,并避免尖銳針頭之傷害等。
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